杨延莲课题组
2023-06-30 恭喜王芃雨同学的文章在Nano Research发表
中心法则是分子生物学的核心原则，描述了DNA转录为RNA，再翻译为蛋白质的遗传信息流动基本原则。DNA、RNA和蛋白质之间的相互作用受到中心法则的规律性约束，并最终影响细胞内和生物体的一系列重要生理过程。RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态非常重要。在传统的蛋白质-RNA相互作用研究中，常以感兴趣的RNA和蛋白质为中心，寻找与其相互作用的蛋白质和RNA。如已经发现了多种RNA结合域（RBD）和RNA识别基序（RRM）等蛋白质-RNA复合物，这些RNA结合结构域能够调控RNA转录、剪切、稳定性和翻译等过程。
长期以来，研究人员围绕着蛋白质-RNA相互作用机理进行了大量的实验和理论研究探索，发现其相互作用模式和强度不仅与RNA和蛋白质的基本组成单元的化学组分有关，包括核糖核苷酸和氨基酸类型；还与RNA和蛋白质的空间构象密切相关。然而在基本结构单位水平对所有常见氨基酸和核糖核苷酸之间相互作用的全面定量测定尚未见报道。通过了解氨基酸-核苷酸相互作用的机制和原理，能够帮助深入理解蛋白质与核酸之间的特异性相互作用模式，从而进一步理解这些相互作用的选择性和特异性如何影响信号传导、基因表达和细胞调控等重要生物学过程，以及与这些相互作用密切相关的遗传多样性和突变的分子机制等。
氨基酸-核糖核苷酸之间的相互作用原理研究对于阐明蛋白质-RNA相互识别规律和本质至关重要。国家纳米科学中心研究人员通过微球辅助的流式细胞术以及概率统计的拟合方法，系统研究了4种单链核糖核酸（ssRNAs）与20种常见氨基酸组成的同型多肽两两之间相互作用的平衡解离常数（KD）和结合自由能（ΔGA），建立了基于大样本量测量氨基酸与核糖核苷酸相互作用热力学平衡常数的实验方法，为深入研究生物系统中普遍存在且至关重要的蛋白质-RNA复合物的结构特征和特异性相互作用的分子机制提供基础。
研究结果表明，氨基酸和核糖核苷酸之间相互作用原理包含以下内容：
1. 氨基酸-核糖核苷酸相互作用是氢键主导的；
2. 氨基酸-核糖核苷酸相互作用强度具有分立的聚类特征；
3.每种氨基酸具有独特的核糖核苷酸相互作用谱，反之亦然。
这些研究结果揭示了氨基酸-核糖核苷酸相互作用的特异性、选择性、多重性和多态性，体现了RNA骨架、RNA碱基以及氨基酸主链和侧链的协同贡献，为深入认识蛋白质-RNA复合物中氨基酸和核苷酸相互作用的选择性等特征提供了分子基础。
在课题组前期的工作中，已经对多肽-多肽相互作用、多肽-DNA相互作用的识别本质和规律进行了探究[Du, H. et al., Principles of inter-amino-acid recognition revealed by binding energies between homogeneous oligopeptides. ACS Central Science 2019, 5, 97–108; Wang, P. Principles of amino-acid-nucleotide interaction revealed by binding affinities between homogeneous oligopeptides and single-stranded DNA molecules. ChemBioChem 2022, 23, e202200048.]。本研究工作阐述的“氨基酸-核糖核苷酸”相互作用原理是“氨基酸-氨基酸”相互作用原理和“氨基酸-脱氧核糖核苷酸”相互作用原理研究的延续工作，它们作为DNA、RNA和蛋白质的基本结构单位，构成了在分子生物学中心法则下与氨基酸相关的相互作用组。这些研究结果对于从基本结构单位水平出发自下而上深入认识和理解分子生物学中心法则和生命活动中的相关分子机制，以及开发RNA纳米递送系统等创新生物技术方法具有重要的基础性意义。
为了探究氨基酸-核苷酸相互识别的本质，研究人员测定了由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、尿嘧啶（U）和胞嘧啶（C）对应的核糖核苷酸组成的4种单链十六聚核糖核酸（ssRNAs）（NT16）与由20个常见氨基酸组成的十肽之间的结合强度。在实验中，如图1所示，我们采用链霉亲和素（SA）修饰的聚苯乙烯微球（PS Microbead）与生物素（Biotin）标记的多肽孵育作为固定相，以捕获流动相中不同浓度的荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记ssRNA，再通过流式细胞仪检测微球上附带的荧光值。
对于每一组相互作用对，可以根据微球荧光的阳性率与流动相ssRNA浓度的依赖关系，并利用Langmuir吸附理论和统计方法，拟合得到Arg10-G16相互作用对的吸附曲线（图2）。图3是80组氨基酸-核糖核苷酸配对组相互作用的结合自由能（kcal/mol），可以发现明显的强相互作用（如Arg-G等）和弱相互作用（如Met-U等）结合模式，这种相互作用的选择性、特异性和多态性体现了RNA骨架、RNA碱基以及氨基酸主链和侧链的协同贡献。甘氨酸链（Gly10）与四种核酸的相互作用存在明显差异，Gly10-A16和Gly10-C16的结合强度明显高于Gly10-U16和Gly10-G16（大于4 kcal/mol）。由于氨基酸主链中的C=O和N-H分子可分别被视为氢键受体和供体，因此推测Gly10与核糖核苷酸之间的相互作用主要是氨基酸主链与核糖核苷酸的磷酸、核糖和碱基之间形成的氢键介导的。
比较ssRNA与天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）等侧链中只有一个甲基单元差异的多肽之间的结合能，可以发现ssRNA与多肽相互作用时对氨基酸侧链结构具有依赖性。如图4(a)(b)所示，Asp10和Glu10、Gln10和Asn10与4种核糖核苷酸相互作用的选择性没有明显差异，这种一致性来源于它们侧链化学成分相似。而异亮氨酸（Ile）、亮氨酸(Leu)与缬氨酸(Val)的侧链存在分支结构，分支结构的长短及甲基的位置会影响其疏水性与相互作用时的空间位阻，因此在图4(c)中，ssRNA与Ile10、Leu10与Val10之间的结合能存在明显差异。
与此同时，对比了四种ssRNA与三种碱性氨基酸（组氨酸（His）、精氨酸（Arg）与赖氨酸（Lys））及两种酸性氨基酸（天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu））的结合能差异（图5）。图5(a)中精氨酸和鸟嘌呤的相互作用特异性与基于蛋白质-RNA复合物结构统计分析的相互作用倾向特征一致，即精氨酸和鸟嘌呤之间的接触倾向是氨基酸和核糖核苷酸之间接触概率最高的。上述观察到的氨基酸-核糖核苷酸相互作用的选择性和特异性表明结合亲和力高度依赖于氨基酸和核糖核苷酸的化学性质、结构特征和局部环境。
进一步将氨基酸-核糖核苷酸相互作用对按照结合自由能分类（图6），发现其表现为明显分立的聚类特征，不同ΔG分立组之间有明显的能量间隙（约为4.5-4.7 kcal/mol）。考虑到不同类型分子间弱相互作用强度范围存在明显差异，推测氨基酸-核糖核苷酸相互作用是氢键主导的。这一结果和课题组前期工作中氨基酸-核糖核苷酸相互作用类似，而与多肽-多肽相互作用的分布趋势明显不同。
图1. 微球表面修饰示意图
国家纳米科学中心博士生王芃雨和高级工程师方小翠为共同第一作者。国家纳米科学中心王琛研究员、杨延莲研究员为共同通讯作者。
